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背景：
轉移性前列腺癌具有很高的致命性。已有報道表明，膽固醇與前列腺癌的發(fā)展有關，但對前列腺癌細胞上皮-間質轉化（EMT）的作用及潛在機制尚不清楚。了解膽固醇在前列腺癌轉移中的作用及具體機制，才能為前列腺癌的治療提供新的策略。

內容概述：
2019年4月，中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所生物醫(yī)學診斷學重點實驗室在期刊Cancer Research（IF₂₀₁₉=9.727）上發(fā)表題為“Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP”的最新論文。在這項研究中，研究者首次發(fā)現脂肪細胞質膜相關蛋白APMAP在前列腺癌侵襲轉移中具有重要作用。APMAP通過減少EGFR的內吞作用參與膽固醇誘導的前列腺癌細胞EMT。該發(fā)現可能為前列腺癌的診斷和治療提供新希望。
 
主要技術：
RNA-seq、蛋白質組學、Co-IP、LC-MS/MS、細胞功能實驗等；
輝駿生物為本研究提供了Co-IP和LC-MS/MS檢測和分析服務。

研究路線：

 
研究結果：
1. 膽固醇誘導前列腺癌細胞EMT的發(fā)生依賴于ERK1/2的激活
研究者首先探索了膽固醇對前列腺癌細胞EMT、細胞遷移和侵襲的作用。采用膽固醇處理前列腺癌細胞后，作者發(fā)現EMT標志物N-cadherin和vimentin的表達升高了，E-cadherin表達降低了，說明膽固醇會影響前列腺癌細胞的EMT；傷口愈合實驗和transwell實驗結果也表明膽固醇處理增加了細胞的遷移和侵襲（圖1C-D）。降血脂藥物辛伐他汀的處理逆轉了上述作用。
另外，通過對ERK1/2, AKT, TGFb和Wnt等幾種調控EMT的信號通路的檢測發(fā)現：膽固醇處理可以使ERK1/2的磷酸化增加。后續(xù)的ERK1/2抑制劑實驗也顯示，膽固醇誘導的細胞遷移和侵襲在兩種ERK抑制劑治療后發(fā)生逆轉，這表明ERK信號通路在膽固醇誘導前列腺癌細胞EMT的過程中至關重要（圖1E-H）。

 
2. 膽固醇促進EGFR和APMAP在脂筏中積累
為了全面了解膽固醇對前列腺癌細胞基因表達的影響，研究者對膽固醇處理的PC-3細胞進行了RNA-seq實驗，并對差異基因做了生物信息學分析，其中KEGG pathway分析結果顯示，差異基因主要富集在EGFR、WNT和VEGF信號通路中，而這些通路都參與了EMT（圖2A）。此外，GO富集分析表明膽固醇可能參與了膜筏相關的過程，如膜筏極化、定位和分布等（圖2B，C）。對前列腺癌細胞的免疫組化實驗也表明膽固醇處理顯著增加了細胞表面脂筏的形成（圖2D）。
為了探索哪些蛋白質參與了EMT過程，作者又采用標記蛋白質組學實驗分析了膽固醇處理前后的PC-3細胞脂筏中的蛋白表達變化，發(fā)現ERK1/2的上游調節(jié)因子EGFR以及和結直腸癌轉移有關的APMAP蛋白在膽固醇處理后的脂筏中均有增加，western-blot實驗也證實了這一結果(圖2E)。為進一步確定APMAP是否參與EGFR的積累，將EGFR-RFP載體轉染至APMAP缺失的PC-3細胞和對照細胞，再用膽固醇處理。在對照細胞中，膽固醇處理增強了EGFR-RFP的熒光，而當APMAP被敲除后，膽固醇對EGFR的影響幾乎完全被抑制(圖2F)。同時，APMAP的敲除削弱了EGFR的積累，從而降低了膽固醇誘導的ERK1/2磷酸化(圖2G)。這些數據表明，APMAP增加了前列腺癌細胞中由膽固醇誘導的EGFR的蛋白水平。

 
3. APMAP通過EGFR促進前列腺癌細胞EMT
接下來，研究者對APMAP基因敲除后的PC-3細胞進行了RNA-seq實驗，對差異表達基因的功能分析顯示：它們富集在MAPK、Notch、粘附相關信號通路以及類固醇生物合成和膽固醇代謝過程中(圖3A)，表明APMAP和膽固醇可能有重疊的功能。APMAP敲除顯著抑制了膽固醇誘導的細胞遷移、侵襲能力和EMT過程(圖3B-D)。相反，APMAP的過表達促進了遷移和侵襲，而EGFR抑制劑則抑制了這一效應(圖3E，F)。此外，EGFR抑制劑顯著抑制了ERK1/2的激活，并抑制了APMAP過表達細胞中EMT標志物的表達(圖3G)。體內實驗的結果與之類似，與對照組相比，注射膽固醇組的細胞明顯形成更多的肝轉移結節(jié)。膽固醇組的轉移瘤組織中，EGFR mRNA、APMAP和Vimentin的表達水平均顯著高于對照組，APMAP基因敲除顯著降低了它們的表達水平(圖3J，K)。這些數據表明APMAP通過調節(jié)EGFR參與膽固醇誘導的EMT過程。

4. 膽固醇通過APMAP降低EGFR的內吞
為了更好的確定膽固醇如何促進脂筏中EGFR的積累，作者采用qRT-PCR技術分析了膽固醇對EGFR轉錄水平的影響，發(fā)現并無影響(圖4A)，這說明APMAP對EGFR水平的調節(jié)發(fā)生在翻譯后。之后又用溶酶體抑制劑“氯喹”和/或膽固醇處理細胞，發(fā)現當不加氯喹時，膽固醇可以增加EGFR的水平，加入氯喹時，膽固醇的加入與否并不影響EGFR蛋白水平 (圖4B)，說明膽固醇對EGFR的作用與氯喹相同，即抑制EGFR的降解。他們接著在膽固醇處理48h后，又采用蛋白質翻譯抑制劑“環(huán)己酰亞胺”在不同時間處理細胞，發(fā)現在APMAP敲除細胞中，膽固醇處理使EGFR的水平顯著降低了(圖4C)。
眾所周知EGFR的降解依賴于其內吞，研究者推測膽固醇對EGFR降解的抑制是通過EGFR的內吞實現的。間接免疫熒光結果顯示，膽固醇處理降低了EGFR和早期內體標志物Rab5在兩個細胞中的共定位（圖4D，E）；APMAP-GFP與Rab5-RFP的共定位增加(圖4F)。接下來，作者探討了APMAP是否抑制EGFR的內吞。轉染EGFR-GFP/Rab5-RFP和APMAP-GFP/Rab5-RFP至PC-3細胞，膽固醇處理后，APMAP沉默的細胞中EGFR與Rab5的共定位增加(圖4G)。這些數據表明，APMAP調節(jié)膽固醇介導的EGFR穩(wěn)定性。
 

5. APMAP通過與EPS15R相互作用抑制EGFR內吞
研究者又使用Co-IP和LC/MS-MS技術篩選了APMAP的結合蛋白，并對它們做了GO和pathway富集分析，數據表明APMAP參與了囊泡運輸。由于EPS15R參與EGFR的內吞，研究者首先通過Co-IP證實了內源性APMAP與EPS15R的相互作用(圖5C)，并且發(fā)現EPS15R的蛋白水平不受膽固醇的影響(圖5D)，質膜免疫熒光顯示，因膽固醇的加入，EPS15R與APMAP的相互作用增強(圖5F)，并與EGFR解離(圖5G)。根據這些結果，研究者推測EPS15R在APMAP介導的EGFR降解中起關鍵作用。為驗證假設，他們在膽固醇處理的DU145細胞中進行了APMAP沉默和/或EPS15R沉默，免疫熒光顯示，APMAP沉默促進EGFR向早期內體募集的作用被EPS15R的沉默所阻斷(圖5H)。在有膽固醇存在的APMAP沉默細胞中，EGFR的蛋白水平因EPS15R的沉默而恢復(圖5I)。這些結果表明，APMAP通過與EGFR競爭結合EPS15R，抑制EGFR內吞到早期內體，從而影響膽固醇誘導的EGFR蛋白的穩(wěn)定性。

 
6. APMAP在前列腺癌中顯著上調
為了了解APMAP在惡性腫瘤中的作用，研究者對15種癌癥中APMAP的轉錄水平進行了分析，發(fā)現前列腺癌組織中APMAP的表達均顯著高于鄰近正常組織(圖6B)。ROC曲線分析顯示APMAP表達在預測前列腺癌組織與正常組織的敏感性和特異性(圖6C)。為探討APMAP在前列腺癌組織和正常組織中的表達情況，對80例前列腺癌患者和8例正常對照的組織芯片標本進行免疫組化染色。結果顯示與正常組織相比，前列腺癌組織中APMAP蛋白的表達增加(圖6D)。APMAP在腫瘤中的表達明顯增高,說明APMAP可作為前列腺癌的潛在診斷標記物。

結論：
先前的研究發(fā)現膽固醇會增加侵襲性前列腺癌的患病風險，本項目研究進一步證明膽固介導APMAP上調，進而抑制EGFR降解，激活ERK1/2通路，從而促進前列腺癌細胞EMT；提出APMAP可能是一種關鍵的調節(jié)劑，為高脂肪飲食、肥胖和癌癥轉移之間提供了聯系。