青青青青久久伊人国产,久久精品国产99久久六动漫,午夜福利精品,亚洲av永久无码精品一区二区,无码国产精品视频一区二区三区,莉莉在线无码视频

中文標題：AR誘導的長非編碼RNA LINC01503促進鼻咽癌SFPQ-FOSL1軸的增殖和轉移

發(fā)表期刊：Oncogene

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：8.756

發(fā)表時間：2020年8月

合作單位：中山大學腫瘤防治中心

運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

鼻咽癌(NPC)是一種起源于鼻咽腔粘膜的上皮性惡性腫瘤，局部復發(fā)和遠處轉移是鼻咽癌死亡的兩個主要原因。因此，識別鼻咽癌復發(fā)轉移的關鍵生物標志物及其機制，對鼻咽癌患者個體化治療的發(fā)展具有重要意義。

通過表達譜分析和功能篩選，研究者已經發(fā)現(xiàn)大的基因間非編碼RNA p21(lincRNA-p21)會損害重編程。長非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸、沒有蛋白質編碼能力的RNA分子，在包括鼻咽癌在內的多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了lncRNA的異常表達。多項研究豐富了大眾對許多生物學過程中LncRNA的理解，但很少有人研究它們在體細胞重編程中的作用。因此，深入研究lncRNA的調控機制，并揭示lncRNA在重編程中的作用，將為鼻咽癌患者提供新的生物標志物和治療靶點。

● 研究結果

1. LINC01503在鼻咽癌中高表達，與預后不良相關

在先前的全基因組lncRNA圖譜中發(fā)現(xiàn)，LINC01503在鼻咽癌組織中高表達(圖1A)。為了證實這一結果，研究者用定量RT-PCR方法檢測了20例鼻咽癌組織和16例正常鼻咽組織中LINC01503的表達水平。結果表明，LINC01503在鼻咽癌組織中明顯過表達(圖1B)；此外，與正常鼻咽上皮細胞NP69和N2Tert相比，LINC01503在11個鼻咽癌細胞系中表達顯著上調(圖1C)。后續(xù)臨床分析結果表明，LINC01503水平高的患者總體、無病和無遠處轉移的生存率比LINC01503水平低的患者差(圖1D-F)。研究者結合LINC01503的表達和TNM分期數(shù)據(jù)，構建了一個預測鼻咽癌(214例)預后的模型，將鼻咽癌患者分為三組，Kaplan-Meier曲線顯示這三組鼻咽癌患者的生存前景不同(圖1G-I)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明LINC01503在鼻咽癌中高表達，可作為判斷鼻咽癌預后的生物標志物。

  圖1

2. LINC01503促進鼻咽癌細胞體外生長、遷移和侵襲                         

為了確定LINC01503在鼻咽癌中的潛在作用，研究者在HK1細胞中特異性地下調了內源性LINC01503的表達，然后進行RNA-seq以確定LINC01503被敲除后所影響的下游基因。針對這些基因的生物信息學分析結果表明，LINC01503與鼻咽癌的進展密切相關（圖2A）。為了驗證這些發(fā)現(xiàn)，研究者使用兩種不同的shLINC01503質粒瞬時下調了LINC01503在HK1和SUNE1細胞中的表達，并進行了體外功能分析(圖2B)。結果進一步表明，LINC01503基因的敲除顯著抑制了鼻咽癌細胞的生長、增殖遷移與侵襲能力(圖2C-F)。

圖2

3. LINC01503與SFPQ直接結合

已有報道表明，LncRNA通過與特定蛋白相互作用而發(fā)揮功能。研究者使用生物素標記的LINC01503正義或反義序列進行RNApull down實驗，然后進行質譜分析鑒定與LINC01503相互作用的蛋白(圖3B)。結果表明，剪接因子SFPQ是高度富集的蛋白之一(圖3C)。為進一步驗證LINC01503與SFPQ之間的相互作用，研究者用抗SFPQ抗體進行了RIP實驗，發(fā)現(xiàn)LINC01503 RNA明顯富集(圖3D)，敲除LINC01503后LINC01503與SFPQ之間的相互作用消失(圖3E)。接下來，為確定LINC01503與SFPQ結合所需的特異性片段，研究者構建了一系列LINC01503截短質粒并進行了RNA pull down實驗，發(fā)現(xiàn)LINC01503的敲除或過表達既不影響SFPQ mRNA水平，也不影響SFPQ蛋白水平(圖3H，I)。這些結果表明，LINC01503可以直接與SFPQ結合。

圖3

4. LINC01503招募SFPQ激活FOSL1轉錄

作為一種多功能核蛋白，SFPQ可以作為轉錄抑制因子或激活因子來調節(jié)基因表達。為了確定LINC01503/SFPQ在鼻咽癌中的靶基因，研究者分析了LINC01503基因敲除前后HK1細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)。在前20個上調和下調的基因中，F(xiàn)OSL1在鼻咽癌組織中過表達，且與LINC01503的表達呈正相關(圖4B，C)。LINC01503或SFPQ的敲除都能降低FOSL1mRNA和蛋白水平(圖4D，E)。接下來，Transfac和Weblogo程序預測到在FOSL1基因的啟動子區(qū)域有兩個SFPQ結合位點(圖4F，G)。ChIP-PCR結果表明，LINC01503基因敲除后，F(xiàn)OSL1啟動子區(qū)域的SFPQ富集現(xiàn)象可被顯著消除(圖4H)。此外，熒光素酶報告分析表明，過表達SFPQ顯著提高了FOSL1野生型啟動子結構的熒光素酶活性，但不能增加突變報告結構的熒光素酶活性(圖4I)。最后，DNase I酶切分析表明，LINC01503或SFPQ基因敲除顯著抑制了FOSL1啟動子位點的染色質可及性(圖4J)。這些結果表明，LINC01503可以招募SFPQ激活FOSL1轉錄活性并增加其表達。

圖4

5. FOSL1負責LINC01503/SFPQ介導的鼻咽癌進展

為了確定LINC01503/SFPQ是否通過激活FOSL1促進鼻咽癌的進展，研究者在HK1和SUNE1細胞中引入FOSL1過表達或空載體，穩(wěn)定下調LINC01503(Sh1503)或其對照(ShCtrl)，CCK-8和集落形成實驗表明，過表達FOSL1可以解除LINC01503基因敲除對細胞生長和增殖的抑制作用(圖5A-C)。Transwell分析表明，LINC01503的過表達逆轉了LINC010503基因敲除對鼻咽癌細胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖5D)。這些結果表明，LINC01503通過激活FOSL1促進鼻咽癌的進展。

圖5

6. LINC01503敲除對鼻咽癌腫瘤生長和轉移的抑制作用

為確定LINC01503在鼻咽癌生長和轉移中的作用，研究者建立了腫瘤生長模型。結果表明，LINC01503基因的敲除顯著延緩了腫瘤的生長，并在大小上明顯小于對照組（圖6A-C）。接下來，研究者建立了腹股溝淋巴結轉移模型(圖6D)，結果顯示LINC01503基因敲除組腹股溝淋巴結較小，重量較輕(圖6E，F(xiàn))；腫瘤侵襲性較弱，對皮膚和肌肉的侵襲能力減弱(圖6G)；腹股溝淋巴結轉移率明顯低于對照組(圖6H，I)。還建立了肺轉移定植模型，結果表明LINC01503基因敲除組肺表面轉移結節(jié)較對照組少(圖6J，K)，轉移結節(jié)較對照組明顯減少和縮小(圖6L)。這些數(shù)據(jù)均表明，LINC01503在體內促進了鼻咽癌腫瘤的生長和肺轉移。

圖6

7. AR激活LINC01503轉錄以增加其在鼻咽癌中的表達

使用Jaspar軟件對LINC01503的啟動子進行分析，預測了兩個轉錄因子：ALX Homeobox 3(ALX3)和AR(圖7A)。研究者發(fā)現(xiàn)AR的敲除明顯降低了LINC01503在HK1和SUNE1細胞中的表達，ALX3的敲除則沒有(圖7B)。此外，AR的過表達增加了LINC01503的RNA表達(圖7C)。更重要的是，AR在鼻咽癌中表達上調，并與LINC01503的表達呈正相關(圖7D，E)。研究者用Jaspar軟件預測了LINC01503啟動子區(qū)域的兩個高親和力結合位點(圖7F)，CHIP-PCR顯示AR的異位表達顯著增強了其在LINC01503啟動子區(qū)域的富集(圖7G)。熒光素酶報告實驗結果表明，AR的敲除顯著降低了野生型LINC01503啟動子結構的熒光素酶活性，但沒有降低突變報告結構的熒光素酶活性(圖7H)。最后，通過DNase I酶切實驗，研究者觀察到AR基因敲除顯著抑制了LINC01503啟動子位點的染色質可及性(圖7I)。這些結果說明AR激活了鼻咽癌LINC01503的轉錄。

圖7

8. AR拮抗劑ENZ可能通過阻斷LINC01503的上游轉錄來抑制鼻咽癌的惡性進展

為了進一步闡明LINC01503的AR配體依賴性激活，研究者進行了AR反應和抑制試驗。結果表明，在AR激動劑雙氫睪酮(DHT)處理過程中，LINC01503呈時間依賴和劑量依賴的激活；在拮抗劑苯扎魯胺(ENZ)存在下，LINC01503呈時間依賴和劑量依賴的抑制(圖8A，B)。有趣的是，DHT處理導致細胞功能的激活，而AR處理則導致細胞功能的抑制(圖8C-E)，接下來，研究者研究了LINC01503的表達對ENZ抑制的鼻咽癌細胞惡性表型的影響，發(fā)現(xiàn)ENZ抑制的細胞生長、遷移和侵襲可以通過增加LINC01503在細胞中的表達來逆轉(圖8F-H)。這些結果證實了AR拮抗劑ENZ可能通過阻斷LINC01503的上游轉錄來抑制鼻咽癌的惡性進展。

圖8