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中文標題：在mir-181a/PPFIA1信號通路中發(fā)現(xiàn)致癌的PARP1，或成為BCR-ABL的靶點并有著潛在的治療作用

發(fā)表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：10.183

發(fā)表時間：2019年

合作單位：暨南大學醫(yī)學院

運用技術：SILAC、免疫共沉淀（Co-IP）（由輝駿生物提供技術支持,點擊查看服務詳情）

● 研究背景

慢性粒細胞白血病(CML)是一種克隆性骨髓增生性疾病，每10萬人中約有1-2人，占成人白血病總數(shù)的15%。MIR-181a在白血病中表達下調，并影響其進展、耐藥性和預后，然而，其靶點在白血病，特別是慢性粒細胞白血病(CML)中的確切作用機制尚不清楚。

● 研究結果

1. MiR-181a在CML中的直接靶基因是PPFIA1

qPCR首先檢測了miR-181a在健康血細胞、人類CML樣本和CML細胞系中的表達水平。結果顯示，miR-181a在人CML樣本和CML細胞系中的水平較低(圖1A)，表明miR-181a的下調可能在白血病發(fā)生有關。因此，研究者采用SILAC蛋白組學和基因芯片技術聯(lián)合分析了miR-181a過表達對CML細胞株K562的影響(圖1C)，結合miRNA靶基因預測，確定了15個候選的miR-181a靶基因。其中，PPFIA1被選作進一步分析(圖1D-E)。qRT-PCR和WB檢測分別確定了PPFIA1基因和蛋白水平在miR-181a過表達的K562細胞中下調(圖1F)。接下來，研究者采用雙熒光素酶報告基因實驗來驗證PPFIA1是否為miR-181a的靶基因。在293T細胞中，miR-181a轉染可顯著降低PPFIA1-3'UTR的熒光素酶活性，但對3'UTR的突變序列沒有作用(圖1G)。這些結果表明，PPFIA1是K562細胞中miR-181a的直接靶點之一。

圖1

2. PPFIA1或miR-181a在慢性粒細胞白血病惡性進展中的作用

接下來，研究者檢測了PPFIA1在疾病和對照樣本中的表達水平，發(fā)現(xiàn)PPFIA1在白血病細胞或組織樣本中表達較高(圖2B)。MTT實驗發(fā)現(xiàn)MiR-181a過表達和PPFIA1干擾均以濃度依賴的方式增加了K562細胞對IM處理的敏感性(圖2A)；Transwell分析和克隆形成實驗也表明，miR-181a過表達或PPFIA1干擾顯著降低了CML細胞的侵襲能力(圖2B)和細胞集落形成能力(圖2C)。當在K562細胞中過表達PPFIA1后，MTT、Transwell細胞侵襲和克隆形成實驗結果顯示，PPFIA1顯著抑制了IM對K562細胞的殺傷作用，細胞活力增加(圖2D)，增強了細胞侵襲力(圖2E)，增加了細胞集落數(shù)(圖2E)。這些結果表明，PPFIA1和miR-181a的表達水平與K562細胞的惡性表型相關。

圖2

3. PPFIA1 siRNA對CML異種移植小鼠模型的抑制作用

為了探討PPFIA1-siRNA的治療潛力，研究者將106個熒光素酶標記的K562細胞注射到NSG小鼠體內，并通過生物成像監(jiān)測siRNA的治療效果。在注射k562熒光素酶細胞5天后，NSG小鼠分別用PPFIA1-siRNA或NC siRNA對照隔天處理共7次。結果顯示，與對照組相比，PPFIA1 siRNA顯著抑制了K562-熒光素酶細胞的生長(圖3A)；接受NC-siRNA治療的小鼠的相對熒光素酶值從接種腫瘤時的1.58e+6上升到8.01e+8（在第21天），而接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠的則從1.56e+6上升到1.35e+8(圖3B)。這些結果表明，PPFIA1-siRNA可以抑制K562-熒光素酶細胞在體內的生長。研究者繼續(xù)分析了體重這一動物模型癌癥惡病質的重要指標，接受NC-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g下降到26.4g，而接受PPFIA1-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g增加到28.4g(圖3C)。接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠比對照組的小鼠存活時間更長(圖3D)。這些結果表明，PPFIA1 siRNA可能是治療CML的一種有前途的藥物。

圖3

4. 通過磷酸陣列分析檢測到PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

為了探索PPFIA1增強CML細胞侵襲性和克隆性的機制，研究者進行了磷酸陣列檢測，通過計算實驗組和對照組(PPFIA1-siRNA/NC和miR-181a mimic/NC)在248個特異磷酸化位點上的磷酸化比率尋找差異位點(圖4A)。在miR-181a模擬轉染組中，23個蛋白位點的磷酸化水平降低，其中7個位點比NC轉染組降低了30%(圖4B)。PPFIA1 siRNA轉染降低了60個蛋白位點的磷酸化，其中8個位點降低了50%(圖4C)。研究者最終確定了受miR-181a mimic和PPFIA1-siRNA處理影響的三個磷酸化靶點，KIT-Tyr721、MAPK-Tyr182和VEGFR2-Tyr951(圖4D)。已知KIT與CML發(fā)病機制有關，因此他們推測miR-181a的靶點PPFIA1可能通過激活K562細胞的KIT信號通路促進惡性表型。在過表達PPFIA1的K562細胞株中，KIT-Tyr721的磷酸化水平顯著增加(圖4E)，而PPFIA1- siRNA則有相反效果(圖4F)。這些數(shù)據表明，PPFIA1可能通過激活CML中的KIT通路而發(fā)揮致癌作用。

圖4

5. PPFIA1和BCR/ABL的重要下游分子PARP1

為了探討PPFIA1和KIT之間的關系，研究者在K562細胞中過表達FLAG-PPFIA1，并分別進行了BCR和FLAG抗體的免疫共沉淀(Co-IP)，對IP產物的質譜分析結果顯示，PARP1蛋白同時與FLAG-PPFIA1和BCR相互作用(圖5A)。分子對接分析表明，PARP1催化結構域可以與PPFIA1 (PDB: 3TAC)和ABL1 結構域(PDB: 5HU9)結合(圖5B，C)，ABL1的F-actin結構域可以與PARP1的催化結構域對接(圖5D)，而SH2結構域不能與PARP1的催化結構域對接。由于無法獲得BCR/ABL融合蛋白，研究者純化了ABL的每個結構域，并進行了表面等離子體共振成像（SPRi）分析，結果證實ABL1的F-actin結構域可以與PARP1結合，與分子對接分析結果一致(圖5E)。此外，Co-IP WB實驗也證實了與PPFIA1和ABL1相互作用的下游分子PARP1（圖5F-5I）?；谶@些結果，研究者推測PARP1介導了PPFIA1和KIT之間的關系。

圖5

6. PARP1通過激活NF-kB-P65轉錄促進KIT表達

已知PARP1是NF-kB轉錄調節(jié)復合物的關鍵成分。因此，研究者推測PPFIA1通過PARP1、P65和KIT通路參與白血病的生長。與預想一致，在K562細胞中過表達PARP1可導致P65表達水平上調，而使用奧拉帕尼(PARP1抑制劑[PARPi])導致P65下調(圖6A-6C)。此外，過表達P65還導致KIT的mRNA和蛋白上調，而P65- siRNA則導致KIT水平下調(圖6D-6F)。這些數(shù)據表明，PPFIA1通過與PARP1相互作用參與了KIT水平的調控，而PARP1調節(jié)NF-kB和P65的轉錄活性。PPFIA1/PARP1/NF-kB-P65/KIT可能在CML中構成了一個調控軸。那么，靶向PARP1是否可以治療CML呢？研究者構建了一個Baf3-P210驅動的過表達PPFIA1的白血病細胞株，發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼顯著抑制了PPFIA1過表達細胞的克隆形成能力(圖6G)。接著，他們將該細胞移植到用3Gy X射線輻射的BALB/c小鼠中，移植小鼠連續(xù)7天單獨服用奧拉帕利布或生理鹽水對照。接受奧拉帕利治療的動物比空載組的動物存活時間更長(圖6H)。這些結果表明，PARP是治療慢性粒細胞白血病的一種有前途的方法。

圖6

● 結論

miR-181a在白血病特別是慢性粒細胞白血?。–ML）中表達下調，并影響疾病發(fā)展、耐藥性和預后。本研究通過基因芯片和SILAC蛋白組學等方法聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)PPFIA1是miR-181a的直接靶基因，并利用CoIP-MS實驗發(fā)現(xiàn)了PPFIA1的結合蛋白PARP1，闡明其通過激活核受體kappa B(NF-kB)和P65的表達而上調KIT蛋白；抑制PPFIA1或PARP1能夠下調c-KIT水平，抑制CML細胞生長，延長小鼠存活期。總的來說，該研究揭示了miR-181a/PPFIA1/PARP1/NFkB-P65/KIT的分子調節(jié)軸，并提出PPFIA1和PARP1可能是潛在的CML治療靶點。