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中文標(biāo)題：LncRNA ILF3-AS1通過抑制海馬miR-212的表達(dá)介導(dǎo)癲癇的發(fā)生

發(fā)表期刊：Aging-US

影響因子：4.831

發(fā)表時間：2020年7月

合作單位：中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

運用技術(shù)：載體構(gòu)建（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

癲癇是由神經(jīng)元異常興奮引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。癲癇持續(xù)狀態(tài)會對神經(jīng)系統(tǒng)和海馬神經(jīng)元造成持續(xù)性和急性損害。這些刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞釋放興奮性氨基酸，導(dǎo)致Ca2+和Na+內(nèi)流，進(jìn)而損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、纖維發(fā)芽、膠質(zhì)細(xì)胞增殖、海馬神經(jīng)元丟失和海馬硬化等。顳葉癲癇(TLE)是最常見的疾病之一，近年來盡管取得了一些治療進(jìn)展，但其潛在機(jī)制仍不清楚。有證據(jù)表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)或活性的增加可促進(jìn)癲癇的發(fā)生，也有人認(rèn)為MMP抑制劑可能是治療癲癇的一種有效方法，但現(xiàn)有的MMP抑制劑缺乏特異性，且副作用嚴(yán)重。MMP上游的分子可能比MMP本身更適合靶向治療。

長非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。多項研究表明，lncRNA在多種疾病的進(jìn)展和發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，包括心血管疾病、椎間盤退變、神經(jīng)退行性疾病和癌癥。LncRNA還被發(fā)現(xiàn)參與許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞發(fā)育、凋亡、干細(xì)胞分化、遷移和炎癥等。在結(jié)腸癌、骨肉瘤、宮頸癌和黑色素瘤等幾種癌癥中均已經(jīng)檢測到一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA ILF3-AS1的異常表達(dá)。此外，H19和RNA-UCA1這兩個lncRNA，近來被證明與癲癇的發(fā)生有關(guān)。因此，本研究旨在研究ILF3-AS1在TLE患者中的表達(dá)是否發(fā)生改變，并評估ILF3-AS1與MMP之間的關(guān)系。

● 研究結(jié)果

1.     ILF3-AS1在TLE患者的海馬區(qū)中過表達(dá)

在這項研究中，41名受試者被分為TLE組（23人）和對照組（18人）兩組，研究者首先分析了兩組患者海馬區(qū)中ILF3-AS1的表達(dá)。如圖1A所示，TLE組海馬區(qū)ILF3-AS1表達(dá)高于對照組。此外，TLE組血清ILF3-AS1水平也高于對照組（圖1B）。

圖1

2. ILF3-AS1與炎性細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系

為探討炎性細(xì)胞因子對TLE中ILF3-AS1表達(dá)的影響，用IL-1β或TNF-α處理星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果表明，IL-1β和TNF-α均能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中ILF3-AS1的表達(dá)(圖2A和2B)。為了進(jìn)一步探討ILF3-AS1與炎性細(xì)胞因子在TLE中的關(guān)系，研究者將pcDNA-ILF3-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致ILF3-AS1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中過表達(dá)(圖3A)。值得注意的是，這種異位表達(dá)還促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β(圖3B)、IL-6(圖3C)和TNF-α(圖3D)的表達(dá)。

圖2

圖3

3. ILF3-AS1過表達(dá)促進(jìn)MMP2、MMP3、MMP9和MMP14的表達(dá)

由于炎性細(xì)胞因子刺激后TLE中MMP2、MMP3、MMP9和MMP14的表達(dá)增強，研究者進(jìn)一步研究了這些基因的表達(dá)是否受ILF3-AS1的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，在異位過度表達(dá)ILF3-AS1的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，MMP2(圖4A)、MMP3(圖4B)、MMP9(圖4C)和MMP14(圖4D)的表達(dá)均有上調(diào)。

圖4

4. ILF3-AS1靶向TLE患者星形膠質(zhì)細(xì)胞和海馬區(qū)的miR-212

為了研究ILF3AS1可能促進(jìn)TLE進(jìn)展的分子機(jī)制，研究者用Starbase分析了其相互作用組，預(yù)測結(jié)果顯示ILF3-AS1可能與miR-212結(jié)合(圖5A)。此外，用miR-212模擬物處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-212的表達(dá)增加(圖5B)。熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染野生型ILF3-AS1報告質(zhì)粒的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，miR-212過表達(dá)降低了熒光素酶活性(圖5C)。相反，強制表達(dá)ILF3-AS1抑制了細(xì)胞中miR-212的表達(dá)(圖5D)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，TLE患者的海馬區(qū)和血清的miR-212水平均低于對照組(圖6A和6B)。

圖5

圖6

5. ILF3-AS1通過靶向miR-212誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子MMP3和MMP9的表達(dá)

為確定ILF3-AS1是否通過抑制miR-212促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和MMP的表達(dá)，研究者進(jìn)行了一系列挽救實驗。在過度表達(dá)IL-1AS1的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，強制表達(dá)miR212降低了IL-1β(圖7A)、IL-6(圖7B)和TNF-α(圖7C)的表達(dá)。同樣，在ILF3-AS1過表達(dá)的細(xì)胞中，miR-212的高表達(dá)降低了MMP3(圖7D)和MMP9(圖7E)的表達(dá)。

 圖7