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RNA pull down?銀染后條帶背景深需考慮是不是SDS-PAGE染色時間過長或者抗體的質(zhì)量問題，多克隆抗體經(jīng)常會出現(xiàn)這種情況，最有可能的情況是樣品中包含的非特異性蛋白太多了，針對這一點(diǎn)，有以下解決措施： 1.優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件； 2.優(yōu)化緩沖體系，使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系； 3.提高裂解液的質(zhì)量。

常用細(xì)胞組織等樣品提取total RNA，其中包含mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA等所有的RNA種類，暫沒有方法直接提取circRNA。但可以對total RNA進(jìn)行RNase R消化處理，以使circRNA得到富集。

CircRNA的形成和線性RNA不同，因此對circRNA的過表達(dá)不能直接將序列連接到常規(guī)的真核表達(dá)載體（如pcDNA3.1）來進(jìn)行。 已明確的circRNA形成依賴于側(cè)翼序列中的反向互補(bǔ)序列（RCMs，如Alu元件）或與能調(diào)控circRNA生成的蛋白（如QKI）的結(jié)合位點(diǎn)，因此構(gòu)建載體時可以在circRNA序列上下游分別增加一段反向

考慮感興趣的circRNA是否能翻譯蛋白，可先以O(shè)RF Finder分析序列基礎(chǔ)，預(yù)測是否有合適的ORF。有一個跨越j(luò)unction的ORF是最理想的，序列內(nèi)部不跨越j(luò)unction的ORF可能和mRNA一樣，沒辦法特異研究circRNA。