在進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們常常會(huì)遇到讓人非常頭疼的抗體輕重鏈污染，下面輝駿生物和大家一起探討這些問(wèn)題產(chǎn)生的原因和解決方法，幫助大家制定更合理的實(shí)驗(yàn)方案。

一．為什么IP時(shí)會(huì)有抗體輕重鏈污染？

眾所周知，Co-IP是研究蛋白與蛋白相互作用的技術(shù)，基于抗體和抗原特異性結(jié)合的原理，采用結(jié)合了目標(biāo)蛋白抗體的beads，調(diào)取樣本中天然結(jié)合的目標(biāo)誘餌蛋白（Bait）及其互作蛋白，去除未結(jié)合的蛋白后，再將復(fù)合物從beads上洗脫下來(lái)，進(jìn)行后續(xù)western-blot或質(zhì)譜鑒定。

由上圖可知，免疫沉淀復(fù)合物包括：Beads、抗體（約25kD的輕鏈+約55kD的重鏈蛋白）、誘餌蛋白和互作蛋白。為了檢測(cè)復(fù)合物中的蛋白，必須將這些蛋白與抗體、beads分離。無(wú)論變性還是非變性洗脫方法，都不可避免的會(huì)將IP抗體一起洗脫下來(lái)，使之殘留在最終的洗脫液中。

當(dāng)后續(xù)進(jìn)行western-blot檢測(cè)時(shí)，洗脫液中的IP抗體也會(huì)被轉(zhuǎn)移到膜上，因此WB二抗不僅會(huì)識(shí)別WB一抗，還會(huì)識(shí)別這些殘留的IP抗體，導(dǎo)致結(jié)果圖中除了目標(biāo)蛋白條帶，還常常有抗體的輕鏈和重鏈條帶。如果恰好目標(biāo)蛋白條帶也在55 kDa或25 kDa左右，則會(huì)和輕重鏈條帶混淆在一起而無(wú)法區(qū)分。

當(dāng)后續(xù)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，IP抗體也被一起酶解和進(jìn)入質(zhì)譜儀，由于抗體的絕對(duì)含量遠(yuǎn)高于樣本中蛋白的含量，這些肽段會(huì)有更大概率的被檢測(cè)到，從而了降低了其他低豐度蛋白的檢出概率，導(dǎo)致鑒定的互作蛋白更少。

二．怎么解決抗體輕重鏈污染？

技術(shù)人員想了一系列的方法來(lái)減少抗體輕重鏈對(duì)IP結(jié)果的干擾，例如：

1、IP抗體選用共價(jià)偶聯(lián)到beads上的抗體；

2、IP抗體選用沒(méi)有恒定區(qū)的納米抗體；

3、選用直接標(biāo)記HRP的一抗；

4、選用只識(shí)別天然構(gòu)象抗體或只識(shí)別抗體輕鏈或重鏈的二抗。

其中方法1和2的抗體不僅售價(jià)很高，而且很多時(shí)候根本買不到。方法3和4只能掩蓋Western-blot檢測(cè)時(shí)的輕重鏈干擾，并不能真正消除這些污染，如果IP后的蛋白需要做質(zhì)譜，它們則無(wú)用武之地。除此之外，我們還能怎么辦呢？

雖然我們很難買到偶聯(lián)beads的誘餌蛋白抗體，但是我們能很容易買到偶聯(lián)beads的標(biāo)簽抗體呀！當(dāng)在樣本中過(guò)表達(dá)帶標(biāo)簽（例如Flag、GFP等）的誘餌蛋白時(shí)，相當(dāng)于給蛋白帶上了“尾巴”，用這個(gè)“尾巴”的抗體beads來(lái)做IP，不僅方便，而且成本低，易于購(gòu)買。目前，生產(chǎn)標(biāo)簽抗體磁珠的廠家很多，最常見(jiàn)的是將普通的flag抗體直接偶聯(lián)在beads，可是當(dāng)小伙伴兒們真正開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)的flag抗體依舊會(huì)殘留在IP洗脫液中，這是為什么呢？

事實(shí)上抗體并不是個(gè)單一蛋白，是由兩條重鏈和兩條輕鏈蛋白共價(jià)偶聯(lián)成的多聚體結(jié)構(gòu)，如果不能保證4條鏈都完全偶聯(lián)在beads上，還是會(huì)有抗體污染，尤其當(dāng)用到比較強(qiáng)烈的洗脫方法時(shí)（例如加入WB loading buffer煮樣洗脫），這種污染尤為嚴(yán)重。

難道沒(méi)有完全無(wú)污染的抗體beads嗎？當(dāng)然有！結(jié)合多年的互作實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜經(jīng)驗(yàn)，輝駿生物開(kāi)發(fā)了專門解決輕重鏈污染問(wèn)題的ChainFree^?標(biāo)簽抗體磁珠，涵蓋了目前主流的多種標(biāo)簽，比如Flag、HA、Myc、V5、GFP、mCherry。該磁珠上偶聯(lián)了經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選、優(yōu)化并重組表達(dá)的無(wú)輕、重鏈的標(biāo)簽抗體，完全解決了抗體污染問(wèn)題，并且采用的是定向偶聯(lián)技術(shù)，抗體磁珠對(duì)誘餌蛋白的親和力很強(qiáng)，每次IP實(shí)驗(yàn)最多使用20ul就可以達(dá)到很好的效果，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白很難表達(dá)或者細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染時(shí)，這個(gè)磁珠就可以極大的發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。

泳道1：轉(zhuǎn)染Flag空載體的HEK-293T細(xì)胞裂解液

泳道2：轉(zhuǎn)染Flag-誘餌蛋白的HEK-293T細(xì)胞裂解液

泳道3：轉(zhuǎn)染Flag空載體的HEK-293T細(xì)胞裂解液采用20 μL ChainFree^? Anti-Flag 磁珠IP后的洗脫液

泳道4：轉(zhuǎn)染Flag-誘餌蛋白的HEK-293T細(xì)胞裂解液采用20 μL ChainFree^? Anti-Flag 磁珠IP后的洗脫液

一抗：Anti-Flag小鼠單克隆抗體1:2500稀釋（輝駿產(chǎn)品貨號(hào)：FI01104）

二抗：羊抗鼠IgG (H+L) ：1:8000稀釋

預(yù)計(jì)分子量大?。?5 kDa

廣州輝駿生物科技股份有限公司ChainFree^?系列產(chǎn)品（現(xiàn)貨）